早上好。我是华盛顿大学的戴威·霍茨曼（David Holtzman）。我今天的演讲主题是《微生物组和载脂蛋白E在Tau蛋白病理和神经退行性变中的作用：来自动物模型的证据》。我要感谢绿谷制药赞助本次研讨会。

目前已有多个围绕肠道微生物组对于阿尔茨海默病病理产生作用的动物研究，主要采用小鼠模型。在这一领域中，大部分被研究的小鼠体内都有淀粉样蛋白沉积。

而且大家刚刚都听到了，Sam Sisodia和其他小组的研究工作已经证明，肠道微生物组的作用可以影响淀粉样蛋白沉积，尤其是在雄性动物中。但迄今为止，几乎没有证据帮助我们理解肠道微生物组的作用是否能够影响Tau蛋白病理或 Tau蛋白介导的神经退行性变。

几年前，在我的实验室研究生Yang Shi和其他合作研究人员的共同努力下发现，如果采用 P301S突变Tau蛋白转基因小鼠，也就是过度表达人类Tau蛋白突变形式的小鼠，其中包括了TE3、TE4和TEKO三种不同基因型的小鼠。在存在突变Tau蛋白和载脂蛋白E4过度表达的情况下，这些小鼠在九月龄的时候会出现严重的神经退行性变，同时伴有内嗅皮层和海马体积萎缩以及脑室体积增大的情况。如果小鼠体内存在载脂蛋白E3和E2，那这样的损伤则会比较轻微。如果体内没有载脂蛋白E，那这样的损伤则基本不会出现。

除了上述发现之外，最近发表的一些研究表明，拥有不同人类载脂蛋白E基因型的小鼠在肠道微生物组方面存在差异。

鉴于其中部分研究结果，我们想提出以下问题。1）干预肠道微生物组是否会影响Tau蛋白介导的神经退行性变？2）这样的影响是不是通过载脂蛋白E和载脂蛋白E基因型发生的？这些是否会影响到干预效果？如果答案是确定的话，它们在这些相互作用中的潜在生化机制是什么？这项研究工作由我实验室的神经内科学系讲师Seo Dong-Oh领导，与华盛顿大学 Jeff Gordon 实验室和芝加哥大学 Sangram Sisodia 实验室合作开展。

因此，对于载脂蛋白E多态性和对肠道微生物组的操纵会如何影响大脑病理，我们目前有三种假设模型。第一种可能性是微生物组根本就不会影响神经退行性变，也就是这里列出的第一个模型。

第二种可能性是载脂蛋白E异构体会改变微生物组，而这种改变可能通过系统因素以某种方式让微生物组对大脑病理产生影响。

然后第三种可能性则包括载脂蛋白E异构体可能会改变微生物组，从而改变大脑病理变化。但除此之外，还会出现调控这一反应的载脂蛋白E局部作用，即所谓的“加性模型”。

因此，我们当时想做的第一件事就是选取表达人类载脂蛋白E的 Tau蛋白小鼠，这些小鼠在九月龄时会出现严重的神经退行性变，然后探讨如果这些小鼠在无菌条件下长大会产生怎样的结果。换句话说，也就是比较具有正常肠道微生物组的小鼠和完全没有肠道微生物的小鼠。

这些实验是在华盛顿大学Jeff Gordon 教授的无菌设施中进行的，在那里小鼠是在完全无菌的条件下饲养的。因此，我们将TE4F基因分型小鼠从出生后便饲养于完全无菌的条件下直至九月龄，并将它们与在常规条件下饲养的小鼠进行比较。或者它们最初是在无菌条件下饲养的，但在剩余的生命周期内暴露于特定的肠道微生物组，也就是在常规设施中饲养的小鼠所拥有的正常微生物组。

然后我们观察了小鼠九月龄时不同大脑区域的体积，因为我们知道在这个病理模型中，小鼠受Tau 蛋白病理影响的大脑区域会出现显著的神经元突触和大脑体积损失。大家在这里可以看到，在常规条件下饲养的TE4F小鼠中，海马体积明显减少。根据我们的评估方案，小鼠海马体的正常大小约为7立方毫米。无菌小鼠对海马体积具有几乎完全的神经保护。

但我们想知道，当无菌小鼠在三月龄成年的时候，如果在它们体内恢复正常小鼠的肠道微生物组会发生怎样的情况。

我们发现，在迄今为止的动物研究中，如果在三月龄的时候将无菌小鼠的肠道微生物组恢复到正常小鼠的微生物组，则同样会恢复出现在正常小鼠身上的神经退行性变，然后也会出现脑室体积增大的现象。在这一模型中，我们没有观察到无菌条件会对内嗅/梨状皮层体积产生重大影响。

我们还观察了齿状回的厚度，齿状回由构成该区域的神经元层组成。大家可以看到，如果小鼠处于无菌条件下，它们的齿状回受到更多神经元数量的保护。如果我们在三月龄的时候给小鼠添加正常微生物组，那这种保护就会不复存在。我们还在海马CA1区获得了类似的发现，至少观察到了这种趋势。

那除了在无菌条件下简单地去除所有肠道菌群之外，我们还能进行怎样的改变？研究人员已经采取的一种方法是让小鼠肠道暴露于抗生素中，并且是主要只让肠道处于暴露状态。在正常情况下，肠道菌群是有特定构成的。通过在相对较短的时间内将肠道暴露于抗生素中，我们可以改变小鼠的肠道菌群构成。然后通过去除抗生素，那之后剩下的肠道菌群构成则与小鼠最初拥有的构成不同。

因此，我们设计了一系列实验，为二至三周龄的未成年小鼠提供左侧列出的抗生素混合物，通过口服灌胃法供药一周。小鼠在这个月龄相当于人类的儿童成长期。这一研究模式已被Sam Sisodia和其他实验室采用，并且已经表明该方案至少可以在雄性小鼠体内预防淀粉样蛋白沉积的形成。我们这项研究有意思的地方在于，我们只给小鼠服用抗生素一周，然后我们对它们剩余的生命周期进行跟踪直至9.5月龄。在此期间，我们对小鼠粪便进行取样来观察肠道菌群变化。然后在实验结束的时候，我们做了行为分析并观察了神经病理。我们在表达载脂蛋白E3、载脂蛋白E4 或根本不表达载脂蛋白E的雄性小鼠和雌性小鼠中开展了这一实验。

在肠道菌群构成方面，我们的一项研究内容是α多样性或者小鼠体内的微生物多样性。大家可以看到，在我们观察的所有不同分组中，在抗生素干预组和对照组中，抗生素干预组的α多样性指数始终较低，即便是在首次给药几个月后。

在服用抗生素的不同小鼠组中，β多样性，即不同生境条件下的微生物相似性，也发生了类似的变化。大家可以看到抗生素干预组的肠道菌群构成相似性指数要比水干预组高出得多。

我们的另一项研究内容是抗生素干预对不同肠道菌门水平的影响。我们的一个发现是，在抗生素存在的情况下，小鼠体内的拟杆菌门/厚壁菌门比例会增加。如果大家看服用水的TE4 小鼠，可以看到这些微生物门的比例在抗生素存在的情况下会发生变化，也就是显示在页面右侧。现在我们尚不清楚这种变化的含义。有意思的是，大家可以看到这种变化发生在 TE3 小鼠和 TE4 小鼠中。

因此，我们也想观察这一抗生素干预在小鼠生命早期会对神经退行性变产生何种影响，所以我们一开始研究了受Tau蛋白病理影响的不同区域的脑容量。

首先需要关注的一个现象是，如果大家观察雄性小鼠的海马体，与对照小鼠相比，TE3和TE4 小鼠的海马体积明显萎缩。完全没有载脂蛋白E的小鼠则一生都未出现损伤。这一现象我们在其他实验中也多次看到。

但在接受抗生素干预的TE3 或TE4 雄性小鼠中，我们在TE3 小鼠的海马体积方面观察到了显著的神经保护作用。在TE4 小鼠中也观察到了这一趋势，但并不显著。大家可以在侧脑室中观察到类似的变化，即侧脑室体积变小，这与 TE3 小鼠的神经保护作用一致，但对 TE4 小鼠没有产生显著影响。

有意思的是，我们在观察TE3和TE4雌性小鼠的时候，发现它们的海马体积萎缩程度已经不像对照小鼠那样严重。当我们给小鼠口饲抗生素时，发现对雌性没有显著影响。这可能是因为损伤量本身也没有那么大，因此需要保护的脑组织也相对较少。

当我们观察海马体中的神经元层时，也会看到类似的影响。我们观察了齿状回。在抗生素干预组中，TE3小鼠的齿状回厚度增加了，虽然不是很显著，并且在TE4小鼠中也观察到了少许增加。

而且，服用抗生素小鼠的 CA1 神经元也受到了保护，至少在雄性小鼠中是这样的，但对雌性小鼠的影响没有那么大。

我们还通过使用AT8磷酸化Tau蛋白抗体染色法来观察Tau蛋白病理。大家可以看到TE3和TE4小鼠的海马体中有相当数量的 AT8 染色。但在抗生素干预组中，染色在TE3 小鼠中有所减少，但在 TE4小鼠中却没有显著减少。正如我们之前看到的那样，在没有载脂蛋白E的小鼠中，磷酸化Tau蛋白抗体染色相当不明显。

我们通过观察小鼠筑巢行为来研究功能。大家可以看到，一只普通小鼠会在24小时内建造一个正常巢穴，我们将这一结果评为5分。然后不同的评分代表不同的筑巢能力。1分代表几乎没有筑成巢穴。大家可以看到，在TE3和TE4小鼠中，它们的平均筑巢能力评分约为2.5，这说明功能是严重受损的。但是在服用抗生素的 TE3 和 TE4 小鼠中，这种筑巢行为得到了明显的保护。大家还可以看到，在 TE3 和 TE4 小鼠中，筑巢行为评分与海马体积呈正相关，所以就是和大脑的结构和功能呈正相关。

当我们观察雌性小鼠的时候，发现它们的筑巢能力评分只是轻微受损。当我们给雌性小鼠服用抗生素时，相关评分并没有出现进一步改善。

我们还研究了小鼠的运动行为。其中一些小鼠在9.5月龄时出现了一些运动障碍，尤其是TE4 小鼠。在悬挂实验行为测试中，大家可以看到它们在服用抗生素后运动表现有所改善。

我现在向大家展示的期中工作总结是，和传统饲养小鼠的大脑体积相比，无菌条件下的TE4小鼠呈现出明显降低的脑萎缩。这是一种极显著的或保护性的影响。和服用水的小鼠相比，短期服用抗生素的雄性 TE3 小鼠呈现的海马萎缩明显更为轻微。在服用抗生素的 TE3 小鼠中，其筑巢行为也与脑容量相关，而服用抗生素的 TE4 小鼠亦是如此。

这些研究结果支持肠道菌群会调节Tau蛋白介导的神经退行性变的假设。这些针对Tau 蛋白介导的神经退行性变的、亚型依赖的影响可能是因为载脂蛋白E亚型在薄壁组织微环境中有着不同的参与形式，也可能和肠道微生物组对大脑薄壁组织微环境的调节方式有关，如右图所示。这一现象的具体发生过程我们稍后再讨论。

既然我们观察到了这些影响，那么导致这些影响的潜在生化机制或相互作用可能是什么？

关于载脂蛋白E是如何对Tau蛋白介导的神经退行性变产生影响的，我们认为正在发生的一个现象是，随着神经元和突触开始退化，小胶质细胞似乎在对突触进行调理，进而导致突触退化。 一种可能性是载脂蛋白E存在于突触中，并以某种方式允许小胶质细胞通过某种机制，也许是某种受体介导的机制，来介导这种影响。

无论如何，肠道微生物组可能会改变许多不同的物质，比如会导致代谢物以差异形式存在于血液中，可能是因为它们会改变炎症因子以进入血液。这些因子一旦影响血脑屏障或影响大脑中的信息，就会与这些载脂蛋白E亚型产生相互作用，并与这些亚型影响神经退行性变的模式产生相互作用。

下面来看总结和下一步研究，我认为我们的研究结果表明 Tau蛋白介导的神经退行性变的发生模式与载脂蛋白E和载脂蛋白E亚型有关，并受到肠道菌群和性别的影响。先天免疫系统的某个亚群可能参与了和肠道微生物组相关的神经退行性变调节行为。

一个非常关键的问题是肠道微生物组与神经退行性变之间相互作用的潜在生化机制是什么？它可能是细胞因子、代谢物、或其他物质。这些就是我们实验室正在开展的实验。

最后，不仅在发育阶段的小鼠中，而且在成年阶段的小鼠中，操纵肠道微生物组是否会对Tau蛋白介导的神经退行性变产生显著影响？不管是在Tau蛋白病理发生之前，就像我刚才演示的那样，还是Tau蛋白病理发生之后。我前面向大家展示了，当我们在无菌小鼠体内恢复正常微生物组时，我们就能恢复神经退行性变。但我们尚不清楚是否可以通过其他方式操纵肠道微生物组，以达到不具破坏性而是具有神经保护作用的影响。

我们目前正在进行页面底部列出的实验，以期寻求这些问题的答案。

最后要感谢我实验室中的许多伙伴，尤其是执行这些实验的Seo Dong-Oh，以及其他跨实验室合作者。还要感谢Jeff Gordon以及他在华盛顿大学的同事，我们一直在这项研究的许多方面进行合作，尤其是无菌条件研究。也要感谢Jonathan Kipnis和他的实验室。还要感谢Sam Sisodia以及在他实验室工作的Hemraj Dodiya。他们在合作推动这些研究项目方面给予了极大的帮助。