侧脑室注射淀粉样蛋白- β诱导肠道菌群失调，与阿尔茨海默病抑制胆碱能抗炎通路相关
Injection of amyloid-β to lateral ventricle induces gut microbiota dysbiosis in association with inhibition of cholinergic anti-inflammatory pathways in Alzheimer’s disease
侧脑室注射淀粉样蛋白- β诱导肠道菌群失调，与阿尔茨海默病抑制胆碱能抗炎通路相关
摘要译文
背景：阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD) 是最常见的神经退行性疾病，其发病机制尚不清楚。AD患者存在肠道菌群失调，更重要的是，肠道菌群失调不仅在AD患者中被观察到，在轻度认知障碍(mild cognitive impairment, MCI) 患者中也被发现。然而，AD患者肠道菌群失调的机制也不清楚。胆碱能抗炎途径是中枢神经系统(central nervous system,CNS) 调节外周免疫平衡的一个重要途径，对肠道而言尤为重要。因此，推测胆碱能抗炎途径功能障碍是导致AD肠道菌群失调的一条潜在途径。
研究方法：本研究通过向侧脑室注射Aβ1-42构建了AD模型小鼠，并通过莫里斯水迷宫实验检测小鼠的认知水平。利用16S rDNA高通量分析的方法，检测各组小鼠在基线、术后2周和4周的肠道菌群丰度。免疫荧光法和Western blot法检测各组小鼠肠道结构、胆碱能抗炎途径以及大脑与结肠淀粉样前体蛋白生成(Amyloid precursor protein, APP) 的改变。
结果：Aβ1-42静脉注射可诱发小鼠认知障碍和大脑神经元损伤。同时，脑室内注射Aβ1-42后4周诱发了肠道菌群的改变，而在基线和注射后2周没有显著变化。并且，在Aβ1-42处理组检测到结肠结构的变化和促炎因子水平增加，同时伴有胆碱能抗炎途径的抑制。Aβ1-42处理组的大脑和结肠淀粉样变性途径均被加速。
结论：本研究表明，中枢神经系统Aβ可诱发肠道菌群失调，改变肠道结构，加速淀粉样变性途径，且与抑制胆碱能抗炎途径相关。
王 盼 博士
天津市环湖医院神经内科副主任医师，博士
中国老年学和老年医学学会脑认知与健康分会委员、中国循环学会神经变性 病专业委员会阿尔茨海默病生物标志物学组委员、天津市医学会神经病学分会睡眠学组委员、天津市医学会罕见病分会青年委员、阿尔茨海默病防治协会委员
研究解读
2022年9月，上海瑞金医院陈生弟、汤荟冬及团队在Journal of Neuroinflamma-tion上发表研究“Injection of amyloid-β to lateral ventricle induces gut microbiota dysbiosis in association with inhibition of cholinergic anti-inflammatory pathways in Alzheimer’s disease”(侧脑室注射淀粉样蛋白- β诱导肠道菌群失调，与阿尔茨海默病抑制胆碱能抗炎通路相关) 。该研究通过向侧脑室注射(i.c.v) 淀粉样蛋白- β1-42 (Aβ1-42) 构建AD小鼠模型，发现中枢神经系统中的Aβ可诱导肠道菌群失调，改变肠道结构，加速淀粉样蛋白生成途径，这与抑制胆碱能抗炎通路有关。
阿尔茨海默病(AD)是最常见的神经退行性疾病，AD的典型病理改变是由细胞外Aβ沉积形成的老年斑和细胞内以过度磷酸化的tau蛋白形成的神经原纤维缠结。到目前为止，一系列研究均已证实神经退行性疾病，如AD及轻度认知功能障碍(MCI) 患者存在肠道菌群失调，且与AD的临床病理特征相关。
本研究将12周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为 对 照组(W T ) 、假手术组(WT+PBS) 、Aβ1-42i.c.v组(WT+Aβ) 三组，每组4-5只。在基线时收集各组的粪便样本后，进行手术给药。术后2周，采集粪便样本。4周后，采集粪便样本，并进行行为学和病理学检测。
本研究采用侧脑室注射Aβ1 -42成功构建了AD小鼠模型，同时研究发现侧脑室注射Aβ1-42可诱导肠道菌群多样性和组成明显改变，引起小鼠肠道结构的改变，包括结肠长度、肠黏膜屏障完整性和肠道神经元数量，证明了脑肠轴-大脑与肠道菌群的双向调节相关性。
下一步也希望在AD小鼠模型中发现肠道神经系统和多种免疫细胞类型的改变证据，未来继续为通过粪便早期诊断AD，通过转移健康菌群或抗生素诱导的扰动，通过定种的肠道菌群敲除及培养改变肠道菌群结构，进而改善病理、神经炎症和认知障碍提供了新的思路。未来我们希望针对肠道菌群的干预策略能有效的延缓AD病程，为AD的治疗带来新的证据和思路。
图1.Aβ1-42i.c.v通过抑制胆碱能抗炎通路促进肠道炎症。迷走神经是最重要的副交感神经，广泛分布于消化系统。迷走神经介导的胆碱能抗炎通路是中枢神经系统维持肠道内稳态的重要途径。因此，本研究为探讨Aβ1-42i.c.v后肠道内稳态的改变是否是通过抑制胆碱能抗炎症途径来实现的，检测了促炎巨噬细胞的膜标志物“CD86”和抗炎巨噬细胞的膜标志物“CD206”的表达水平。结果显示，Aβ1-42i.c.v组结肠中CD86表达增加，CD206表达降低(图1A、D、E)；Aβ1-42i.c.v组促炎细胞因子TNF- α和IL-1β的mRNA水平显著升高，而抗炎细胞因子IL-10的水平显著降低(图1H- L)；Aβ1 -42i.c.v组胆碱乙酰转移酶 (CHAT) 的表达水平明显降低，但未改变胆碱乙酰胆碱受体的α7亚基(图1A-C，G)，提示Aβ干预能抑制结肠胆碱能抗炎通路。
图2.Aβ1-42i.c.v降低M1型乙酰胆碱受体的表达，促进小胶质细胞的活化。既往研究报道，前脑是胆碱能抗炎通路的高级加工中心，并通过M1型乙酰胆碱受体(M1AChR) 参与外周调控。因此，分析了各组M1AChR的表达和分布。结果显示，对照组和假手术组的前脑、海马中M1AChR的表达水平显著高于Aβ1-42i.c.v组(图2A、D) 。此外，免疫印迹结果显示，Aβ1 -42i .c .v组M1R的表达降低，并且突触后蛋白PSD95的表达降低(图2B，G，H)，而突触前蛋白Synapsin1在三组间均无明显差异(图2B、F) 。此外，Aβ1-42i .c .v可促进小胶质细胞的增殖和激活(图6C，E) 。综上所述，Aβ1-42通过促进小胶质细胞的激活和降低M1AChR的表达来抑制胆碱能抗炎通路。
综上所述，Aβ通过降低AD大脑中M1型乙酰胆碱受体(M1 mAChR) 的表达水平来抑制迷走神经介导的胆碱能抗炎通路。 在肠道中，抑制胆碱能抗炎通路导致肠道巨噬细胞表面的Ach受体α7乙酰胆碱受体(α7 nAChR) 激活减少。然后，巨噬细胞通过上调NF-kb信号通路，向促炎表型转移，损伤肠神经元，破坏肠黏膜屏障，促进肠淀粉样变途径。最后，在AD中发生肠道菌群失调。
图1.Aβ1-42 i.c.v抑制胆碱能抗炎通路，提高结肠炎症因子水平。A-F各组结肠中CHAT、CHRNA7、CD206、CD86、 NF-kb的免疫印迹试验及定量分析。G各组结肠内CHAT的免疫荧光。比例尺，100 μm。H-L 各组结肠内炎症因子 (TNF- α、IL-1β、IL-6、Arg-1、IL-10) 的实时荧光定量PCR及定量分析。每组n=6。数据以平均值±标准误差表示。统计数据采用单因素方差分析(ANOVA)，其次是Fisher最小显著性差异法(LSD) 进行分析。P<0.05，**P<0.01，ns无统计学差异。
图2.Aβ1-42 i.c.v降低了海马和皮质中M1型乙酰胆碱受体(M1 mAChR) 的表达。A、D各组海马(CA1、CA3、DG) 和皮质中M1 mAChR的免疫荧光和定量分析。比例尺，200 μm。C，E各组海马DG中TMEM119的免疫荧光及定量分析。比例尺，200 μm。B、F、G、H 各组结肠内突触蛋白1、PSD95、M1 mAChR的免疫印迹试验及定量分析。每组n=6。数据以平均值±标准误差表示。统计数据采用单因素方差分析(ANOVA)，其次是Fisher最小显著性差异法(LSD) 进行分析。P<0.05，**P<0.01，ns无统计学差异。
